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新生隐球菌病研究进展

核心提示: 美国耶什华大学阿尔伯特爱因斯坦医学院的研究人员称,他们发现了新生隐球菌如何躲过人类免疫系统并导致疾病的过程,该发现有 美国耶什华大学阿尔伯特爱因斯坦医学院的研究人员称,他们发现了新生隐球菌如何躲过人类免疫系统并导致疾病的过程,该发现有助于开发针对新生隐球菌感染的疫苗。

2012-06-11 10:15

核心提示: 是什么将真菌伙伴转变成了病原体,这个问题已经困扰了研究人员一个多世纪。然而,直到最近,科学家才发现了支配真菌如何运作、并将正常情况下平和的真菌转变成人类敌人的一些关键原理。在试图破译微生物和人类宿主之间分子对话的过程中,真菌研究者还发现了人体免疫系统的一些令人吃惊的秘密。

该研究负责人苏珊娜·佛瑞丝瓦哈尔表示,这些真菌最易感染免疫系统受损的患者,特别是艾滋病患者和因器官移植而必须采取终身免疫抑制治疗的患者。据估计,全球每年因真菌感染导致的死亡人数高达100万,而其中撒哈拉以南地区就有近60万。

摘 要:隐球菌是条件致病性深部真菌,易发于细胞免疫功能受损的人群。新生隐球菌是隐球菌属的重要致病菌,属环境腐生菌,可从土壤和鸽粪中分离到,并被认为是人和动物最主要的传染源。医学方面,近年来由新生隐球菌引起的感染有逐渐增多的趋势,主要引起人的脑膜炎和肺炎。动物医学方面,可引起马的呼吸道病、牛羊的乳腺炎。鸽是隐球菌的自然宿主,但并不引起发病。该文从隐球菌病的病原特征、分类、毒力因子、致病性等生物学特性进行了概述,并对人和动物新生隐球菌病的传染和流行的基本环节、发病机制、临床表现、防治等方面的研究进展进行了综述。

是什么将真菌伙伴转变成了病原体,这个问题已经困扰了研究人员一个多世纪。然而,直到最近,科学家才发现了支配真菌如何运作、并将正常情况下平和的真菌转变成人类敌人的一些关键原理。在试图破译微生物和人类宿主之间分子对话的过程中,真菌研究者还发现了人体免疫系统的一些令人吃惊的秘密。在细菌的世界里,真菌通常缺乏病毒或细菌的天赋。对拥有正常的、健康的免疫系统的人们来说,真菌很少会表现它们自己。其实,人类的头发和皮肤上携带着大量的真菌,甚至每次呼吸都会带出一片无形的真菌孢子云团。虽然许多其它微生物乐于让宿主因感染它们得病或死亡而苟延残喘,但真菌却往往愿意痴心地等待它的主人死于其他原因而不是自己之手。

新生隐球菌首先通过肺部感染侵入人体,而后蔓延至包括大脑在内的其他各处器官,被称为隐球菌病,可导致胸痛、干咳、腹部肿胀、头痛、视力模糊等症状。如未及时得到抗真菌药物的治疗,隐球菌病可以致命。

关键词:隐球菌病;新生隐球菌;防治

事实上,在整个文明史中,大多数真菌成了人类的朋友,它们慷慨地为人类提供面包和啤酒,回收垃圾,让植物从土壤中汲取营养。科学家估计,在地球上大约生活着150万种真菌,但只有少数会祸害人类的健康。

研究人员发现,新生隐球菌外表有一层类似胶囊一样的薄膜在其感染人体过程中起着重要的作用。当真菌进入人体后,其外膜便开始增大。当真菌的外膜增大到一定程度,人体免疫系统中负责清除病毒的巨噬细胞便无法将其吞噬。但研究人员现在还没有理解导致真菌外膜增大的机制。

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)为酵母样,呈圆形或卵圆形,芽殖,细胞直径为4 μm~20 μm,在组织中菌体较大,经培养后变小,均有胶样物质的黏多糖荚膜,厚约1 μm~2 μm,是一种特异的可溶性半抗原,分为A、B、C、D和AD 5个血清型,临床分离株多为A和D型。澳大利亚环境中分离出的新生隐球菌以血清B型为主,占67.7%,与该国桉树的分布广泛有关。国内报道从临床分离的新生隐球菌83%~89%为新生变种,17%~19%为格特变种[1],我国致病性隐球菌血清型分布的特点是:以A型为主,D型少见,有少量的AD型,缺乏C型。

但问题是,一旦少数害群之马真的“起了歹心”,那它们就会反目成仇,致人于死命。例如,在严重感染曲霉属真菌的病人中,有一半的人将一命呜呼。医院中最常见的念珠菌感染的死亡率据报告也是相当高的,虽然具体数字很难获取,但报告显示真菌感染率在整体上具有上升的趋势。最近,医生们也开始对一度罕见的隐球菌感染在西北太平洋地区的扩散表现得忧心忡忡。

经过分析,研究人员发现新生隐球菌保护外膜的主要成分是多聚糖,有较长的糖分子链。佛瑞丝瓦哈尔和同事通过利用一种被称为动态散射的技术发现,真菌外膜会将越来越多的糖类聚集在外膜的边缘,从而形成巨大的分子,使外膜沿着轴线向外扩张。

医学方面,1894年从人体和桃汁中分离并确认新生隐球菌为一种人类致病性病原微生物[2].隐球菌病主要侵犯中枢神经系统和肺脏,亦可原发或继发于皮肤、黏膜、骨骼、肝脏等器官。病情呈急性、亚急性或慢性过程。尤其多发于免疫功能低下的成人、大剂量应用糖皮质激素及抗肿瘤化疗药物的病人、肿瘤患者、获得性免疫缺陷综合征患者(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),以及使用抗移植排斥药物的病人[3].

不吃腐肉的“秃鹫”会害人

该发现将为药物介入治疗开创新的研究方向,并将为基础多聚糖生物学开创新的研究领域。目前人们对多聚糖还理解甚少,科学家们之前认为多聚糖只是简单增长到一个特定长度,并没有什么研究价值,但这项新研究暗示多聚糖中似乎存在一套人们还不知晓的复杂机制。

本病的感染者遍布于全世界,我国北京、上海、天津、宁夏、广东等10多个省市均有报道,且发病率有逐渐增多的趋势。

自2004年白色念珠菌的完整基因草图发表以来,研究人员已编目了十余种致病真菌的基因组。这些基因组研究可能会很快揭示出真菌是如何在人体中生存的,并帮助研究人员提出新的方法来消灭这些病菌。科学家最近还发现了人类免疫细胞中会对真菌和其他入侵者发出警报的分子家族,以及真菌躲避这些细胞的机制。

动物医学方面,犬、猫、猪、牛、马、猴、兔、鼠和禽类都易感染本病。可引起马的呼吸道病,牛的急性乳腺炎,乳房淋巴结肿大,乳汁浓稠呈灰白色。如果饮用污染的生牛奶,则会危害公众健康[4].鸽带菌但不发病。

总的来说,这些研究结果可能很快就会解决真菌感染治疗中最具挑战性的一个问题,即如何让你摆脱这个人类最亲密接触者的骚扰。

在我国医学方面,对新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)已进行了较系统的研究。生态学方面,由鸽粪分离的环境株具有表型的多态性,包括新生变种的A、D血清型及尿素酶阴性株,而这些多态性菌株均已在临床发现[5].在病原分子生物学方面,G C mol%和核型已被进行分析。临床方面,研制的一种新的可同时检测酚氧化酶和尿素酶的培养基可用于该菌的临床鉴定。使用一种高渗培养基诱导出于该菌的L型,提示在感染期间L型的形成可能与该病的慢性过程与复发有关。已证实氟康唑对治疗新生隐球菌病有良好的效果。进一步应重视联合治疗的可能性,例如使用氟康唑加两性霉素B脂质体。总之,在我国对新生隐球菌的系统性研究已经开始进行,并将取得许多有意义的进展。

在过去的生物学归类中,真菌往往与植物混为一谈,大概就是因为这两种形式的生命都可以萌芽于污浊的环境。今天,真菌已被公认自成一体,拥有自己的王国,在漆黑的海洋深处、南极零度以下的冰雪层下、冰箱里被遗忘的苹果中都能找到它的影踪。

1 隐球菌的分类和生物学特性

真菌包括霉菌、酵母、蘑菇及其他不从叶绿素和光获取能量的生长物。许多真菌依靠散布微小的孢子来繁殖,每一个孢子都有传播的本领。即便你看不到真菌的倩影,它们每天也都和你朝夕相处。2005年的一项研究发现,光在你的枕头上就依偎着大约一百万个真菌孢子。

1.1 隐球菌的分类

真菌是生态系统的“秃鹫”,通常都喜爱即将或已死亡的食物。例如,曲霉属真菌通常会逡巡在腐烂的树叶和堆肥周围,尽享一顿腐烂物大餐。但有的时候,当条件成熟时,某种真菌也会开始发芽,而此时它的主人却依然生机勃勃。这件事如果发生在人身上,通常就会给人带来不小的麻烦,如皮肤和指甲感染等,但这还不至于要了你的命。

隐球菌属包括17个种和7个变种,根据新生隐球菌多聚糖荚膜成分和生化方面的差异,人们将新生隐球菌分成3个变种。新生隐球菌按血清学分为A、B、C、D和AD型5个型[6].新生变种(Cryptococcus neoformans var neoformans,血清型D)、grubii变种 (C.neoformans var grubii,血清型A)和格特变种(C.neoformans var gattii,血清型B、C),此外,还发现了新生变种和grubii变种的杂合体。但目前被认定的是2个变种,即新生变种A、D型和AD,格特变种的B和C型。

研究人员表示,大多数真菌病原体是相当“懦弱”的,它们通常不会在拥有正常免疫系统的宿主身上引发疾病。

1987年,国内9个地区60株新生隐球菌中,A型占多数,D型少见,有一定比例的B型和AD型,未见C型。新生隐球菌的格特变种则是一种可以真正引起健康个体感染的病原菌,主要见于热带和亚热带地域。

但总有些人拥有不那么正常的免疫系统。大多数这样的患者都因罹患艾滋病或癌症、进行过器官移植或是药物治疗而使身体变得不再拥有强大的抵抗能力,此时真菌感染就会将这些患者陷于死地。越来越多的此类病人往往使用高剂量的抗生素,以防止其他感染,这从根本上改变了身体的自然生态,从而使那些非自然的真菌得以滋长,接管了身体。还有很多的患者同时还会经历插入医用导管或其他医疗器械等医疗程序,这也会打破人体正常的免疫屏障。

1.2 生物学特性

念珠菌病虽然在上一代前比较少见,但这种得自念珠菌属真菌的血液感染症已成为第四大常见的感染症。虽然没有对曲霉属真菌引发的感染进行过仔细跟踪,但研究表明,在20世纪80年代和90年代期间因曲霉属真菌感染而死亡的人数翻了两番。

隐球菌(Cryptococcus)为直径4 μm~8 μm的圆形或卵圆形厚壁孢子,内有大小不等的颗粒,周围有黏多糖构成的宽阔而有折光性的胶质样荚膜,后者具有抗原性,且与隐球菌的毒力有关。有时可见出芽孢子,但无菌丝。隐球菌其无性生殖阶段属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球菌酵母目、隐球菌酵母科、隐球菌酵母属;其有性阶段属于担子菌亚门、冬孢菌纲、黑粉菌目、黑粉菌科、拟线黑粉菌属[7].

与人太亲密使治疗难下手

新生隐球菌属不全菌类隐球菌目、隐球菌属,是一种酵母样真菌。新生隐球菌在组织中呈圆形或椭圆形,直径为4 μm~6 μm,个别达20 μm.革兰氏染色阳性,过碘酸锡夫染色(Periodic-Schiff stain,PAS)菌体呈红色,菌体为宽厚透明的荚膜,荚膜比菌体大1倍~3倍。

治疗真菌感染的药物开发工作一直难以取得进展,因为真菌与人类共享许多特性,从进化的角度来看,真菌比任何其他形式的生命更接近动物王国。如果你把蘑菇放在你的比萨上,蘑菇和你之间就会拥有比番茄酱更多的共同点。同样地,真菌与人类之间的密切关系也更甚于病毒和细菌,这使得抗击真菌感染成了一个棘手的课题。

培养特性方面,本菌在培养基上生长的菌落为酵母型,初为乳白色,逐渐转为棕黄色。普通培养基生长良好,生长最适宜温度为30 ℃。隐球菌荚膜的主要成分荚膜多糖是确定血清型特异性的抗原基础,并与其毒力、致病性及其免疫性密切相关。

与其他种类的细菌不同的是,无论真菌还是人都是真核生物。他们的共性是,其细胞都有一个细胞核,而细胞核都有自己的细胞膜。事实上,由于真菌细胞与动物细胞太像了,因此关于人类生命的很多基本知识,都是从对面包师所用的酵母所进行的研究中收集来的。

生化特性方面,该菌可在37 ℃生长,产生荚膜,尿素酶试验阳性,是隐球菌属中惟一的能产生酚过氧化酶而分解含有二酚或多酚化合物而使培养基底物产生黑色素的种。油菜籽和咖啡酸玉米琼脂就是利用此特点来做菌种的鉴定。另外,能产生黑色素也是判断是否为毒力株的一个指标。利用这些独特的生物学特性,可以用于鉴定,特别是尿素酶阴性株的鉴定[8].

为了对抗感染,抗菌药物往往会利用入侵生物体细胞和人体细胞之间的一些分子差异。但是,在真菌治疗过程中,人体组织更可能发现将自己推入了火坑之中。虽然越来越多的现代抗真菌药物与其“前辈”相比要温和些,但首个得到广泛使用的抗真菌剂——两性霉素B却是以剧毒闻名天下。

主要致病菌种为新生隐球菌新生变种、格特变种和grubii变种。已报道可引起人类疾病的还有浅黄隐球菌、浅白隐球菌和罗伦特隐球菌等,但均较少见[9].

美国威斯康星大学麦迪逊分校的布鲁斯·克莱因说,“当我们进化得如此相似时,我们就很难获得仅针对真菌的药物”。治疗细菌感染的药物往往瞄准的是细菌细胞膜内的分子。但是,如果药物对真菌膜展开攻击,治疗过程也往往会伤到人体细胞。

2 流行病学

先天免疫是抗真菌先遣队

新生隐球菌广泛存在于土壤和鸽粪中,偶可在水果、蔬菜、牛乳以及健康人体的口腔、鼻腔、咽部、胃肠、皮肤等处分离到。隐球菌病在世界各地均有发生,可发生于任何年龄组,以20岁~30岁的人群多发,儿童相对少见。较多发生于男性,呈散发性分布。我国新生隐球菌血清型分布以A、D型为主,尤其是A型。Tietz H J等[10]活检研究柏林一地区内源性深部真菌病的病人,发现隐球菌病发病率位于第三。

但是,人体和霉菌之间还是有区别的。最值得注意的是,真菌细胞将它们自己遮蔽在一个坚硬的外壁中,以抵御湿度和温度的突然变化。

2.1 传染来源

真菌细胞壁正是人类与真菌的主要不同之处。美国马萨诸塞大学医学院的斯图尔特·列维茨认为,细胞壁虽然保护真菌免受外界环境的侵扰,但它也可成为其致命的弱点。

新生隐球菌是一种广泛存在于自然环境中的条件致病菌,可从水果、蔬菜、土壤、桉树花和各种鸟类排泄物中分离出,其中从鸽粪中分离出的新生隐球菌被认为是人类感染的最重要来源[11].

至少对免疫系统来说,真菌细胞壁的最重要的基础结构是称为β-葡聚糖的大葡萄糖分子。近年来,研究人员已着手编制一份可识别真菌β-葡聚糖分子并与之反应的人体免疫细胞表面受体分子的细目清单。受体扮演着门卫的角色,将细胞的外部与其内部运作联系在一起。通过检查这些受体,研究人员即可“窃听”人体与真菌之间的分子串扰。

鸽粪是新生隐球菌新生变种临床传染的重要来源,中性、干燥鸽粪易于本菌的生长,其他禽类如鸡、鹦鹉、云雀等的排泄物亦能分离出隐球菌。

研究发现,真菌刚进入人体时,防御力量主要依赖于“先天免疫”,常规上,这个如鸟枪般的免疫反应可征募某些类型的白血细胞发现和摧毁入侵者。“适应性免疫”则是另一类免疫,需要较长的时间才能施展拳脚,过程涉及专门对抗感染的白血球细胞,并针对特定目标产生抗体以提供长期防护。

桉树是新生隐球菌格特变种的主要来源,澳洲的树袋熊为其携带者。

虽然人类产生大量的抗真菌抗体,但先天免疫被认为是对真菌发起攻击的先遣队。这个基本的防御机制在整个动物王国均可发现,甚至连马蹄蟹都使用先天免疫能力保护自己免受真菌的侵袭。

Malik R等[12]用抗隐球菌抗体检测正常的猫、狗、马、树袋熊的血清抗体水平,对患有隐球菌病的狗和树袋熊用酶免疫测定;80%以上有隐球菌感染的猫和狗的抗体水平在诊断、发病期间、成功治疗后升高;“正常”的动物中抗体检测提示猫和狗先前感染率为10%,马为3%,树袋熊为5%.

科学家们推测,一个理性的真菌不会像其他微生物那样给人类带来如此多的疾病,因为“我们的先天免疫力进化得非常非常之好,因此人体能够识别真菌,并以各种不同的机制对真菌做出反应”。由此带来的结果是,真菌并没有进化成像细菌、寄生虫和病毒那样显著的人类病原体。而植物就没有这么幸运,尽管植物和真菌具有长期和密切的互动关系,但真菌是显著的植物病原体,每年毁掉的世界收成占到了百分之十左右。

新生隐球菌格特变种是桉树的寄生菌,属致病菌。有文献报道,由格特变种所致隐球菌病的发病率和地区分布与桉树尤其是赤桉树和细叶桉树的种植和分布有密切关系。澳大利亚桉树在世界范围内广泛引种,因此,对于我国引起临床感染的格特变种与桉树或其他自然环境的关系仍需进一步调查,从而有可能彻底预防隐球菌感染的发生。

遗传缺陷让真菌有机可乘

2.2 传播途径

在识别真菌的蛋白质中最重要的一类是Toll样受体,之所以如此命名,是因为它们类似于一个被称为Toll的果蝇分子。作为受体,它们会在遭遇来自真菌和细菌的蛋白时开启,并关闭细胞内的其他反应。一个法国研究小组1996年在《细胞》杂志上发表报告称,Toll受体基因发生突变的果蝇会异常容易地感染曲霉属真菌。在人类白血细胞中,尤其是两个Toll样受体——TLR2和TLR4似乎就卷入了身体与真菌的鏖战之中。

一般认为由呼吸道吸入为隐球菌主要的传播途径,引发肺部感染,进而累及其他部位。消化道可能是另一种途径,由皮肤直接侵入也可能是一种途径。

2008年,美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的科学家在《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究成果证明,TLR4具有抗真菌的作用。研究人员对接受骨髓移植后又发生曲霉属真菌感染的患者进行了研究分析。在一般情况下,约10%到15%的移植患者会发展成危及生命的曲菌病,但现在尚不清楚为什么其他85%至90%的患者能逃过此劫。

2.3 易感宿主

研究人员发现,一个遗传基因引发了已病者体内的TLR4发生故障。科学家们认为,如果没有一个正常的TLR4,这些患者的免疫反应或许就已被削弱。对造血干细胞捐赠者的此一突变进行基因检测,或许有一天就能确定哪些患者在移植后需要特别的照顾或注意。

人群对隐球菌普遍感染,以青壮年较多见,男性多于女性。但有一定的自然免疫能力,很多健康人群可能感染但不导致疾病的发生。感染多发生于免疫功能低下者,如大剂量应用糖皮质激素、化疗药物等。肿瘤、AIDS以及移植后抗排斥药物的使用等也易诱发本病。AIDS患者中新生隐球菌病是最常见的能引起生命危险的真菌病,估计AIDS患者中的感染率为5%~10%,发达国家应用人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)三联疗法感染率有所下降,但在像乌干达这样的发展中国家发生率依然很高。

《新英格兰医学杂志》去年发表的两份研究报告也描述了遗传缺陷会导致真菌疾病易感性的增加,证实其他受体在真菌防护中的作用。其中一个便是dectin-1,dectin-1于2001年被首次确认为真菌防御的关键因素。Dectin-1伙同TLR受体可制造出既能攻击真菌又能部署其他白血细胞协助抵抗感染的物质。

欧盟医学真菌基金2001年发表的在奥地利、德国、瑞士调查隐球菌病的流行病学资料表明,AIDS依然是最重要的危险因素。研究表明[13],20%~60%的HIV阴性隐球菌病人发生于器官移植接受者,同时表明,在这些病人中隐球菌进展更为迅速,这些病人中有61%~87%在被诊断为真菌感染时正在应用泼尼松,每日大剂量的泼尼松被认为是可能的危险因素。

去年10月,一个国际研究小组对一个特殊家族进行了遗传学研究。在该家族中,其他方面均为健康的妇女似乎特别容易在阴道、手指和脚趾部位发生慢性念珠菌感染。研究人员发现,是一种遗传性基因改变导致了dectin-1缺陷。

新生儿一旦受到新型隐球菌感染,也很容易侵犯中枢神经系统而致脑膜炎,其传染途径可能是当分娩时经过带有该菌的产道而受感染;有某些新生儿出生后便即刻发生症状,这不能不使人考虑到通过胎盘传染的可能性[14].

第二个研究小组则调查了另一个家族,该家族的成员容易周期性感染念珠菌,有时甚至是致命的。英国伦敦大学学院主导的一个研究小组发现,另外一种遗传突变也可使一个人更易遭受真菌感染的侵害。当dectin-1检测到真菌时,它会激起一个链式反应,将免疫细胞设置在战斗模式。研究人员发现,突变会干扰该链中的一个环节,也就是一个被称为CARD9的分子。在这种情况下,dectin-1虽然被正确触发,但该机制堵塞了之后更远的路线。

易感动物有犬、猫、猪、牛、马、猴、兔、鼠和禽类。

虽然这样和那样的发现为理解免疫系统如何工作带来了新的认识,但人们对于人体究竟如何处理与真菌关系等更多问题仍是云里雾里。最令科学家揪心的问题则是,与宿主细胞关系如此紧密的这些生物体是如何做到在不触发警报的情形下生存和繁衍的。

3 致病性

真菌披着“隐形斗篷”

3.1 致病机理

于是,研究人员将研究重点主要放在了会引发肺部感染的组织胞浆上。这类真菌孢子生长在被称为巨噬细胞的白血细胞内。巨噬细胞是一种先天免疫细胞,负责摧毁像真菌这样的入侵微生物。

基本病理变化有两种,早期为弥漫性浸润渗出性病变,晚期为肉芽肿形成。早期病变,可以在组织中出现多量的新型隐球菌集聚成团。任何组织均可受累。由于菌体四周包绕胶样荚膜,使菌体与组织没有直接接触,所以组织的炎症反应不明显。但在少数已经失去荚膜的菌体周围,则可出现较明显的炎性细胞浸润。肉芽肿的形成常在感染数月之后出现,包括巨细胞、巨噬细胞及纤维细胞的增生,并有大量淋巴细胞的浸润,个别的可有小型的坏死灶及蜂窝状小空洞形成,脑组织较其他组织更易形成小空洞。隐球菌可出现在巨细胞和巨噬细胞的内外,在渗出性或坏死性病灶中隐球菌数目很多,而在肉芽肿病灶中,则很少发现。

虽然组织胞浆使用的隐形策略在很大程度上依然是一个谜团,但科学家最近报告说,曲霉属真菌也许能躲开免疫系统,它从哈利波特那里借来了工具:隐形斗篷。

3.2 毒力因子

虽然人体吸入的每立方米空气中可能包含一千个甚或更多的曲霉属真菌孢子,但免疫系统似乎都不会察觉到。科学家们一直不清楚这到底是为什么。终于,在2009年8月的《自然》杂志上,法国巴斯德研究院的研究人员给出了一个解释:人体的免疫系统无法对孢子作出反应,是因为免疫系统根本不知道它们的存在。通常情况下,孢子外层覆有一层小纤维茸,也称为“棒形层”。在小鼠实验中,研究人员发现纤维本身并不刺激免疫系统。然而,当研究人员从细胞外层去除这些纤维茸时,裸露的孢子激起了强烈的免疫反应。

新生隐球菌用墨汁染色后,在普通的显微镜下可以观察到其特殊的细胞壁外的荚膜结构,经电镜放大后,荚膜主要是由放射状排列的荚膜多糖纤维束构成的细密网状结构。新生隐球菌的荚膜是细胞外层的物理屏障,并且在多种水平调节宿主免疫反应,是研究新生隐球菌致病机理的重要内容。

由此看来,棒形层可能允许真菌孢子隐藏在体内,一直等到有利于发芽的条件出现。研究人员还发现,当曲霉属真菌孢子开始生长时,外覆层会瓦解,免疫系统此时就开始发威。

过去几年,Kwon-Chung等应用经典的遗传学方法鉴定了数个表型特征明显的新生隐球菌毒性因子,如荚膜多糖、黑素、磷脂酶B、尿素酶、甘露糖醇等,其中荚膜多糖是第一个被明确认为与致病力有关的隐球菌毒力因素。

不要小瞧任何一种真菌

3.2.1 荚膜多糖 荚膜多糖是新生隐球菌主要的毒性因子,在隐球菌病动物模型的研究中,用非特异性的方法产生的无荚膜突变株的毒性要比有荚膜的野生株弱。体外试验表明,无荚膜酵母细胞比产荚膜的菌株或加了多聚糖的无荚膜株更易被吞噬,遗传学研究也支持荚膜的产生与其毒性相关。产生甘露醇,对人中性粒细胞的杀伤较敏感。

科学家们最近还发现某些真菌还有其他的诱骗技巧。在今年3月18日的《自然》杂志上,研究人员揭示,一种能够攻击植物的真菌属成员可彼此传递基因,而这种横向传递能力被认为几乎只可发生在细菌中。这一发现意味着,能够对药物产生基因抗性的真菌在理论上可与邻近生物体共享此一秘密。

3.2.2 黑素 黑素是新生隐球菌经典的毒性因子之一,黑素具有抵抗吞噬的保护作用,它处于菌体细胞壁内表面,黑素主要由酚氧化酶催化产生的。编码酚氧化酶的结构基因CNLAC1的cDNA序列已经测定。由于黑素是一种强的抗氧化剂,因此,在隐球菌抗吞噬作用中,它可能有清除氧自由基对菌体的破坏、抗吞噬细胞的氧化杀菌的作用[15].

更令研究人员震惊的是,这些真菌交换基因简直轻而易举。研究人员只是把不同的真菌基因样本并排放在培养皿中一起培养,就跟踪到了基因的转移。这跟大自然中发生的情形没有太大不同。

3.3 临床症状

虽然没有人知道是否还有其他真菌也能如此轻易地共享基因,但此项发现强化了绝不应低估任何一种真菌的思想。为了成功地征服感染,下一代疗法必须做到一次击中多个目标。

3.3.1 对人的致病性 可表现为中枢神经系统隐球菌病、肺隐球菌病、皮肤黏膜隐球菌病、骨隐球菌病及内脏隐球菌病等。

有研究人员将目前的真菌治疗方法比作上世纪60年代和70年代的癌症疗法,那时大部分癌症疗法的设计将快速增长的细胞而不是特定的癌细胞作为靶标。今天,医生拥有的很多药物可集中火力攻击恶性肿瘤细胞的特殊缺陷,药物鸡尾酒处方也可使几种癌症机制同时失效。真菌感染似乎有类似的复杂性,包括共享非靶标细胞的特性等,因而也将需要同样复杂的治疗方案。

3.3.2 对动物的致病性 新生隐球菌可在多种哺乳动物宿主中引起感染。自新生隐球菌最早描述以来,人们已应用一系列动物种群研究其致病机理,其中小鼠、豚鼠、大鼠和兔应用最为广泛[16].

关键字:真菌 致病 关键机理 病原体

已有报道新型隐球菌会导致奶牛的乳房炎,如果食用污染的生牛奶则会危害公众健康。奶牛新型隐球菌性乳房炎的症状是:乳房淋巴结肿大,乳汁浓稠灰白色;可用病原菌的培养、涂片染色及乳房组织活检对其诊断。一旦确诊应淘汰病牛,勿饮生乳。

4 诊断与检测

根据临床表现中新型隐球菌经常引起的中枢神经系统疾病、肺部疾病、骨组织、皮肤黏膜、内脏等的变化进行诊断。确诊需要进行实验室诊断。

4.1 实验室诊断

4.1.1 病原的分离鉴定 采取脑脊液、痰、脓、尿、粪、血、活体组织及尸体解剖材料等直接涂片,采用常规细胞染色可发现隐球菌,但极易误诊。墨汁染色,可见圆形厚壁孢子,菌体直径约4 μm~20 μm,外围有一透光的厚荚膜,厚度约5 μm~7 μm,荚膜内的菌体可出芽或不出芽,孢内有一较大的反光颗粒(脂质颗粒,不是孢核)和许多小颗粒,可与白细胞或淋巴细胞相鉴别。

真菌培养仍然是确诊的“金标准”,然而培养的阳性率并不高。在沙堡氏琼脂(Sabouraud agar,SDA)于25 ℃或37 ℃培养时,2 d~5 d即生长出乳白色细菌黏液性菌落[17],呈不规则圆形,表面有蜡样光泽,以后菌落增厚,颜色由乳白、奶油转桔黄色;咖啡酸玉米琼脂(carffeic acid corn-meal agar,CACA)和油菊籽培养基(Niger seed agar,NSAHKUYFTG)皆可产生褐色菌落[18];在多巴培养基上可出现肉眼可见的黑素[19].非致病性隐球菌在37 ℃不生长。快速鉴定:①37 ℃生长;②尿素酶阳性;新生隐球菌能够产生尿素酶,常用沙堡弱培养,新生隐球菌产生的尿素酶分解尿素,使培养基变为红色;③咖啡酸变棕色,咖啡酸试验阳性;④生化试验不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。

4.1.2 血清学诊断 血和脑脊液标本隐球菌抗原检测能早期快速诊断,具有重要的临床价值。目前隐球菌血清学检测方法已作为临床常规的诊断方法,主要检测隐球菌的荚膜多糖特异性抗原。方法有乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和单克隆抗体法,其中乳胶凝集试验最为常用[21].血清特异性抗隐球菌抗体检测包括放射免疫法和试管凝集试验,是对隐球菌的间接检测方法,对预后判断有一定的临床价值。

血清学诊断对隐球菌病的早期诊断和早期治疗甚为重要。为了提高早期诊断率,血清学方法检测隐球菌荚膜多醣体抗原是早期诊断的主要手段。国内已成功建立了ABC-ELISA法、双夹心ELISA法、免疫放射测定法检测新生隐球菌抗原,具有极高的检测特异性和敏感性。

4.1.3 分子生物学检测 应用DNA探针法和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)探针等方法,具有高度的特异性。不仅可以特异性地检测出新生隐球菌,不受治疗的影响,而且可以区别变种。可以用于感染早期的诊断。特别是PCR方法敏感性更高,可用于痰液、支气管、肺泡灌洗液及经支气管吸出物的检测[20].

目前,免疫学分型方法仍是经典的分型方法,一些新的分子生物学技术己经补充了新生隐球菌分型研究方面的不足之处,如运用最广泛的PCR指纹分析技术,该技术最优势的是随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)指纹技术。PCR指纹技术是随着DNA指纹技术和PCR技术的发展而有机结合的产物,PCR指纹技术克服了传统DNA指纹技术操作繁琐且费时的缺点,同时由于应用较长引物(15 bp~17 bp),比RAPD方法(使用的单引物一般为9 bp~10 bp)重复性好[21].Wit M D等[22]采用PCR指纹技术对11株不同血清型的新生隐球菌参考菌株进行了DNA多态性分析,结果在种、血清型以及菌株水平上呈现特征性的扩增产物。

5 防治

目前治疗隐球菌病的方法包括原发病的治疗、抗真菌药物治疗、对症治疗、免疫抑制疗法以及手术治疗等。对隐球菌感染的疫苗研究也日益引起重视。

抗真菌药物是对隐球菌病的主要治疗方法。主要有两性霉素B、两性霉素B脂质体、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5-FC)、氟康唑及伊曲康唑。治疗方案尚未统一。但多以两性霉素B为基础,联合其他药物的方案为主。Patterson A等[23]认为治疗隐球菌性脑炎单独应用两性霉素B即可,可以用两性霉素B脂质体替代两性霉素B,以减少两性霉素B的毒副作用;动物试验提示,两性霉素B、5-FC、氟康唑联合用药更好[24].Antoruadou J等[25]认为隐球菌目前耐药较少见,但应规范用药;对个别的耐药情况,可以应用体外耐药性试验或动物耐药性模型试验,选择用药。Khachornsakdi S等[26]对AIDS患者所伴有隐球菌病的治疗,常规治疗后再应用氟康唑200 mg/d 维持一段时间。治疗原发病对本病的治疗十分重要,如治疗HIV感染、停用糖皮质激素、抗肿瘤药物、抗排斥反应药等,遗憾的是很多情况下难以做到。

6 展望

新生隐球菌作为隐球菌属的重要致病菌,该菌主要感染免疫缺陷的患者,尤其是AIDS病人,引起严重的脑膜炎,病死率高达30%.可侵犯人或动物诸多组织器官,引起严重的隐球菌病,死亡率高达18%~37%,是一种人畜共患的传染病。目前,人们在新生隐球菌致病机制的分子生物学方面进行了较为深入的研究,明确了其毒力因子在菌体致病过程中的主要作用,但是目前在动物感染方面研究很少。

研究新生隐球菌不同的血清型与致病性之间的关系是重要的流行病学研究课题。目前在隐球菌疫苗的开发研究方面已取得了一定进展,一种根据隐球菌荚膜多糖成分甘露聚糖合成的疫苗已研制成功,动物试验表明有特异性的保护作用。加强对隐球菌的基础和临床研究,包括毒性因子[27]及有关新药的研究、体外药敏试验与体内效果相关性研究、真菌耐药机制研究、不断优化治疗方案及并发症的防治是我们面临的艰巨任务。

原标题:新生隐球菌病研究进展

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